蛋白質(zhì)組

　　主要功能

　　蛋白質(zhì)組學(xué)集中于動態(tài)描述基因調(diào)節(jié)，對基因表達(dá)的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定量的測定，鑒定疾病、藥物對生命過程的影響，以及解釋基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制.作為一門科學(xué)，蛋白質(zhì)組研究并非從零開始，它是已有20多年歷史的蛋白質(zhì)(多肽)譜和基因產(chǎn)物圖譜技術(shù)的一種延伸.多肽圖譜依靠雙向電泳(Two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)和進(jìn)一步的圖象分析；而基因產(chǎn)物圖譜依靠多種分離后的分析，如質(zhì)譜技術(shù)、氨基酸組分分析等.

　　由于可變剪輯及RNA編輯的存在，許多基因可以表達(dá)出多種不同的蛋白質(zhì)。因此，蛋白質(zhì)組的復(fù)雜度要比基因組的復(fù)雜度高得多。
如果某物種的基因組全序列已經(jīng)破譯，并不代表該物種的蛋白質(zhì)組也已破譯。具體分析某個基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物要綜合基因組水平、轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的修飾及調(diào)控來確定。

　　研究內(nèi)容

　　主要有兩方面，一是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)，二是功能蛋白質(zhì)組學(xué)。其研究前沿大致分為三個方面：

　　①針對有關(guān)基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的生物體或組織細(xì)胞，建立其蛋白質(zhì)組或亞蛋白質(zhì)組及其蛋白質(zhì)組連鎖群，即組成性蛋白質(zhì)組學(xué)。

　?、谝灾匾^程或人類重大疾病為對象，進(jìn)行重要生理病理體系或過程的局部蛋白質(zhì)組或比較蛋白質(zhì)組學(xué)。

　?、弁ㄟ^多種先進(jìn)技術(shù)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，繪制某個體系的蛋白，即相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)，又稱為“細(xì)胞圖譜”蛋白質(zhì)組學(xué)。

　　此外，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，又出現(xiàn)了一些新的研究方向，如亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)、定量蛋白質(zhì)組學(xué)等。蛋白質(zhì)組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要研究方法。

　　技術(shù)原理

　　雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)

       雙向凝膠電泳技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的研究蛋白質(zhì)組學(xué)的方法。雙向凝膠電泳技術(shù)利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量差別將各種蛋白質(zhì)區(qū)分開來。雖然二維凝膠電泳難以辨別低豐度蛋白，對操作要求也較高，但其通量高、分辨率和重復(fù)性好以及可與質(zhì)譜聯(lián)用的特點(diǎn)，使其成為目前最流行、可靠的蛋白質(zhì)組研究手段。雙向凝膠電泳技術(shù)及質(zhì)譜基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究程序?yàn)闃悠分苽?rarr;等電聚焦→聚丙烯酰胺凝膠電泳→凝膠染色→挖取感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)→膠內(nèi)酶切→質(zhì)譜分析確定肽指紋圖譜或部分氨基酸序列→利用數(shù)據(jù)庫確定蛋白。蛋白質(zhì)組研究要求有高分辨率的蛋白質(zhì)分離及準(zhǔn)確、靈敏的質(zhì)譜鑒定技術(shù)。凝膠電泳中蛋白質(zhì)的著色不僅影響蛋白質(zhì)分離的分辨率，同時也影響后續(xù)的質(zhì)譜鑒定。蛋白質(zhì)的染色可分為有機(jī)試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色四類。
Unlu等提出了一種熒光差異顯示雙向電泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法。差異凝膠電泳(DIGE)是對2-DE在技術(shù)上的改進(jìn)，結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒ǎ谕粔K膠上共同分離多個分別由不同熒光標(biāo)記的樣品，并第一次引入了內(nèi)標(biāo)的概念。兩種樣品中的蛋白質(zhì)采用不同的熒光標(biāo)記后混合，進(jìn)行2-DE，用來檢測蛋白質(zhì)在兩種樣品中表達(dá)情況，極大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性。在DIGE技術(shù)中，每個蛋白點(diǎn)都有它自己的內(nèi)標(biāo)，并且軟件可全自動根據(jù)每個蛋白點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)對其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實(shí)的。DIGE技術(shù)已經(jīng)在各種樣品中得到應(yīng)用。

　　高效液相色譜技術(shù)(HPLC)

       盡管二維凝膠電泳（2-DE）是常用的對全蛋白組的分析方法，但其存在分離能力有限、存在歧視效應(yīng)、操作程序復(fù)雜等缺陷。對于分析動態(tài)范圍大、低豐度以及疏水性蛋白質(zhì)的研究往往很難得到滿意的結(jié)果。Chong等使用HPLC/質(zhì)譜比較分析惡性腫瘤前和癌癥兩種蛋白質(zhì)差異表達(dá)。利用HPLC分離蛋白質(zhì)，并用MALDI-TOF-MS鑒定收集的組分，從而在兩種細(xì)胞中的差異表達(dá)中對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。多維液相色譜作為一種新型分離技術(shù)，不存在相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)的限制，通過不同模式的組合，消除了二維凝膠電泳的歧視效應(yīng)，具有峰容量高、便于自動化等特點(diǎn)。二維離子交換-反相色譜(2D-IEC-RPLC)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的多維液相色譜分離系統(tǒng)。

　　飛行時間質(zhì)譜技術(shù)

       表面增強(qiáng)激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜技術(shù)于2002年由諾貝爾化學(xué)獎得主田中發(fā)明，剛剛產(chǎn)生便引起學(xué)術(shù)界的高度重視。SELDI技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中比較理想的技術(shù)平臺，其全稱是表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-tof)。其方法主要如下：通常情況下將樣品經(jīng)過簡單的預(yù)處理后直接滴加到表面經(jīng)過特殊修飾的芯片上，既可比較兩個樣品之間的差異蛋白，也可獲得樣品的蛋白質(zhì)總覽。因此，在應(yīng)用方面具有顯著優(yōu)勢。SELDI技術(shù)分析的樣品不需用液相色譜或氣相色譜預(yù)先純化，因此可用于分析復(fù)雜的生物樣品。SELDI技術(shù)可以分析疏水性蛋白質(zhì)，PI過高或過低的蛋白質(zhì)以及低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)(<25000)，還可以發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)處理的樣品中許多被掩蓋的低濃度蛋白質(zhì)，增加發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的機(jī)會。SELDI技術(shù)只需少量樣品，在較短時間內(nèi)就可以得到結(jié)果，且試驗(yàn)重復(fù)性好，適合臨床診斷及大規(guī)模篩選與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，特別是它可直接檢測不經(jīng)處理的尿液、血液、腦脊液、關(guān)節(jié)腔滑液、支氣管洗出液、細(xì)胞裂解液和各種分泌物等，從而可檢測到樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的分子量、PI、糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)等參數(shù)。

　　同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽(ICAT)技術(shù)

　　同位素親和標(biāo)簽技術(shù)是一種用于蛋白質(zhì)分離分析技術(shù)，此技術(shù)是蛋白質(zhì)組研究技術(shù)中的核心技術(shù)之一。該技術(shù)用具有不同質(zhì)量的同位素親和標(biāo)簽(ICATs)標(biāo)記處于不同狀態(tài)下的細(xì)胞中的半胱氨酸，利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對混合的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。來自兩個樣品中的同一類蛋白質(zhì)會形成易于辨識比較的兩個不同的峰形，能非常準(zhǔn)確的比較出兩份樣品蛋白質(zhì)表達(dá)水平的不同。ICAT的好處在于它可以對混合樣品直接測試；能夠快速定性和定量鑒定低豐度蛋白質(zhì)，尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等；還可以快速找出重要功能蛋白質(zhì)。

　　由于采用了一種全新的ICAT試劑，同時結(jié)合了液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜，因此不但明顯彌補(bǔ)了雙向電泳技術(shù)的不足，同時還使高通量、自動化蛋白質(zhì)組分析更趨簡單、準(zhǔn)確和快速，代表著蛋白質(zhì)組分析技術(shù)的主要發(fā)展方向。針對磷酸化蛋白分析以及與固相技術(shù)相結(jié)合ICAT技術(shù)本身又取得了許多有意義的進(jìn)展，已形成ICAT系列技術(shù)。

　　生物信息學(xué)技術(shù)

　　生物信息學(xué)在生命科學(xué)研究中起著越來越重要的作用。利用生物信息學(xué)對蛋白質(zhì)組的各種數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，也是蛋白質(zhì)組研究的重要內(nèi)容。生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可缺少的一部分。生物信息學(xué)的發(fā)展，已不僅是單純的對基因組、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的分析，而且可以對已知的或新的基因產(chǎn)物進(jìn)行全面分析。在蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫中儲存了有機(jī)體、組織或細(xì)胞所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)信息，通過用鼠標(biāo)點(diǎn)擊雙向凝膠電泳圖譜上的蛋白質(zhì)點(diǎn)就可獲得。

　　鑒定方法

　　如蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)在不同條件下的表達(dá)水平等信息。目前應(yīng)用最普遍的數(shù)據(jù)庫是NRDB和dbEST數(shù)據(jù)庫。NRDB由SWISS2PROT和GENPETP等幾個數(shù)據(jù)庫組成，dbEST是由美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）和歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)共同編輯的核酸數(shù)據(jù)庫；計(jì)算機(jī)分析軟件主要有蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜分析軟件、蛋白質(zhì)鑒定軟件、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測軟件等。

　　研究進(jìn)展

　　2014年5月28日，英國新一期《自然》雜志公布兩組科研人員分別繪制的人類蛋白質(zhì)組草圖。這一成果有助于了解各個組織中存在何種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)與哪些基因表達(dá)有關(guān)等，從而進(jìn)一步揭開人體的奧秘。

　　上世紀(jì)90年代，人類基因組計(jì)劃開始成形時，有科學(xué)家提出了破譯人類蛋白質(zhì)組的想法。其目標(biāo)是將人體所有蛋白質(zhì)歸類并描繪出它們的特性、在細(xì)胞中所處的位置以及蛋白質(zhì)之間的相互作用。但人類蛋白質(zhì)組的規(guī)模和復(fù)雜性使此類研究困難重重。

　　研究人員借助計(jì)算機(jī)對這些蛋白質(zhì)片段與基因組進(jìn)行了大量比對工作，并據(jù)此列出一個“清單”，描繪出哪些組織中的哪些基因表達(dá)與蛋白質(zhì)的形成有關(guān)。在另一項(xiàng)研究中，美國約翰斯&middot;霍普金斯大學(xué)研究人員與印度等國同行也采用質(zhì)譜分析法繪制出一張蛋白質(zhì)組草圖。